ELISA试剂盒常见问答

涉及说明书操作内容以2019年版说明书为准。

1、问：牛免疫球蛋白G（IgG）ELISA Kit 

购买试剂盒目的是为了检测区分牛血清是否是从吃过奶的牛的采集。胎牛、新生牛和小牛的IgG范围，有相关数据吗？

答：

胎牛血清IgG：38.3±16.2μg/ml

小牛血清IgG：8.6±2.5mg/ml

新生牛血清IgG：16.8±4.1mg/ml

注意：

1）后面单位，胎牛免疫球蛋白G（IgG）很少的

2）图片产品非实验数据中牛免疫球蛋白G（IgG）实验对象

2、问：看说明书里，如果样本浓度高，可以不用稀释，直接加原液。这个直接加血清原液，你们自己亲自做过吗？因为之前我们用别家的，他们说明书里，加样是：10微升样品加40微升样品稀释液。咨询他们如果如果浓度高，可以加原液吗？他们说可以，可能他们没做过，说可以。可我们做了，不可以。问他们，又说是可能离子浓度不够。

答：ELISA试剂盒检测范围是固定的，样本是否稀释是根据样本实际浓度来选择的，但前提条件样本要落在检测范围内，浓度高于检测范围，稀释样本达到检测范围内，浓度低于检测范围，那这个试剂盒灵敏度是不够的。离子浓度跟样本浓度没有关联不是影响ELISA试剂盒检测的关键。

3、问：双抗夹心法中，最后TMB用硫酸终止，测量OD450的时候是用单波长450nm还是双波长测量？如果是后者，参考波长是哪个？630nm可以吗？

▲图片来源网络

答：如果有条件的话，就用双波长450nm，630nm。如果没有，单波长也可以。

4、问：牛免疫球蛋白G（IgG）试剂盒（ELISA）样本PH值对这个指标影响大吗？

▲图片来源网络

答：有，要保持中性。不要太偏酸和太偏碱。规定最佳PH=7.2-7.4，可耐受PH5.0-9.0，此外PH值都不适用。

5、问：样本PH值偏小，用氢氧化钠调PH值合适吗？

答：合适，而且必须调！我们之前做的静脉注射免疫球蛋白PH=4，都是要调PH到中性。然后再测定。

6、问：

小鼠白细胞介素-12（IL-12 P35）ELISA Kit

小鼠白细胞介素-12（IL-12 P40）ELISA Kit

小鼠白细胞介素-12（IL-12 P70）ELISA Kit  

三个指标有什么区别和联系？

答：完整的IL-12由两条链通过二硫键相连，称为P70，而这两条链分别称为P35和P40。

IL-12是一由p35和p40（IL-12β）两条链组成的异源二聚体，两个亚单位通过二硫键连接在一起，这种结构在已发现的IL中所罕见。通常情况下，p40的量远超出p70，在鼠中已观察到p40同源二聚体的产生，是由转染的细胞分泌的，p40同源二聚体没有生物学活性，但它能和IL-12Rβ结合，与p70竞争性争夺IL-12受体（IL-12R）而拮抗其生物学作用。单独的p35不具有生物学活性，但却是合成p70的限速因子。

-----来源于百度百科

天然IL-12（p70 ）具有独特的异源二聚体结构,是由p40 和 p35两个亚基通过二硫键共价连接而成的糖基化肽链〔相对分子质量为(70～75)×103〕.IL-12 p35和p40基因定位于不同的染色体,各自受不同的启动子和增强子调节,按需生成有活性的p70或拮抗性p(40)2及单体p40.活性形式的IL-12 p70需要两条亚基共同表达,并以1∶1形式进行自然组合.对已报道的IL-12基因载体来说,存在p40和p35不匹配的组合形式〔5-7〕.构建rhscIL-12融合基因,可使其在一个启动子的控制之下,翻译表达活性蛋白,保证p40和p35以1∶1比例形成单链异二聚体。

白介素-12是p70,p40是其中的一个亚基。

7、问：单核巨噬细胞的趋化因子有哪些？

答：CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL17和CCL22

固体样本处理问题

1）组织样本必须保持鲜重，如果是冻存的组织，应该室温平行2小时以上，然后用生理盐水冲洗干净，再用滤纸把周围的水分吸干，称重！组织重量不能低于50mg。

2）组织匀浆液选取是PBS（PH=7.2-7.4，浓度为0.01mol/L）匀浆的比例为1:10，相当于1g组织加9ml的匀浆液。

3）组织匀浆后，离心取上清，离心转数为5000转，但不能超过5000转，时间为15分钟。

4）实验中老师样本提取的是200mg的样本加1.8ml的匀浆液。

土壤样本处理一般分为2个步骤，第一个步骤是测定含水率，第二个步骤是进行匀浆，按照10%混匀离心取上清待检。具体操作如下。

第一部分：

1）称取土壤500mg左右，必须保持鲜重，按照重量和体积比加入1:10的PBS溶液（PBS的浓度为0.01mol/L,PH控制在7.2-7.4），例如称取的是0.5g加入5ml的PBS，称取的重量不要求保持一致，但匀浆的比例都是按照1:10的关系来。

2）进行涡旋震荡，充分混匀，涡旋时间30秒。

3）离心取上清，离心转速为4000转每分，时间为15分钟左右，取上清液待检。

第二部分：

称取500mg左右的样本，进行烘干，前后称取重量，测定含水率。（这个是为后期剔除掉含水率）

1）称取样本中的重量不小于50mg，一般以1g为基准,但不严格要求固定样本每个重量必须达到相同的水平。

2）匀浆的比例选取10%，相当于1g粪便加9ml的匀浆液来进行匀浆。

3）匀浆液选取PBS（PH=7.2-7.4，浓度为0.01mol/L）。

4）离心取上清，离心转速选用5000转每分，时间是15分钟。取上清液待检！